'효소'를 이용한 DNA 재조합 방법 - 유전자 조합에 사용되는 효소의 종류

지난 포스팅에서 효소를 이용하여 원하는 DNA 절편을 확보하는 방법에 대해서 알아보았습니다. 이렇게 확보한 DNA 절편을 사용하여 클로닝 하는 과정에 대해 소개해드리겠습니다.

2. DNA 절편을 클로닝 운반체에 연결
절단된 운반체와 공여 DNA의 많은 절편을 담금질하면 부착성 말단이 염기쌍을 이루어서 분자를 무작위로 결합하게 한 후 DNA 연결 효소로 결합합니다. 이 중 어떤 운반체는 관심이 있는 유전자와 결합한 것이 있습니다. 운반체가 가져야 할 중요한 특징은 숙주에서 자율적으로 복제될 수 있어야 한다는 것입니다.

3. 숙주 세포 안으로의 침입
재조합 분자가 숙주 박테리아 안으로 삽입되는 것은 운반체 종류에 달려있습니다. 가장 간단한 것은 플라스미드입니다. 플라스미드는 어떤 박테리아의 염색체 밖에서 독립적으로 존재하며, 복제할 수 있는 이중가닥으로 된 환상의 DNA입니다. 플라스미드는 한 개 또는 여러 개의 항생제 저항 유전자를 가지고 있기 때문에 이것이 클로닝 운반체의 기본이 되는 것입니다. 박테리아를 차가운 염화칼슘 용액으로 처리한 후, 42℃에서 2분간 짧은 열 충격을 주면 외부에서 첨가한 플라스미드 또는 재조합 플라스미드가 숙주 내에 들어갑니다.

4. 선택
원하는 클론을 신속하게 선별하는 것이 중요하며 클론의 선택은 2단계로 나누어집니다. 첫 번째로, 운반체로 사용되는 벡터는 전술한 바와 같이 2개 또는 그 이상의 항생제 저항 유전자를 가지고 있습니다. 두 번째는, 스크리닝 단계는 효소가 새로운 박테리아에서 발현되는가 확인하는 단계입니다. 
식품 산업체에서 효소 생산을 증가시키기 위한 대부분의 노력은 경제적으로 감당할 수 있는 낮은 비용으로 효소를 대량생산 하는 것에 초점을 두고 있습니다. 유전자 재조합 효소는 효소의 구조나 기능을 변화시키지 않기 때문에 천연효소를 대체하고 있습니다.

- 효소 파트의 주요 용어 정리
 효소: 효소는 생물체에서 일어나는 화학반응을 촉매시켜 주는 생 촉매로 기질과 반응하여 생성물을 생산합니다.
 아포효소: 비타민류 등의 보효소를 함유하는 복합 효소 가운데 단백질 부분입니다. 아포 엔자임 또는 주효소라고 합니다.
 지모 겐: 단백질 분해효소에 의한 펩타이드 사슬의 부분 분해(한정 분해)를 받아 비로소 효소 활성을 가지게 되는 효소의 전구체입니다.
 홀로효소: 효소 활성에 필요한 보결 분자적이 금속이온 등과 단단히 결합하고 있는 상태의 효소입니다.
 활성제: 효소 작용이 어떤 물질의 첨가로 촉진되는 현상을 효소의 활성화라고 하고 그와 같은 작용을 하는 물질입니다.
 가수분해효소: 물 분자를 가하여 기질의 공유결합을 가수 분해하는 효소입니다.
 유전자 재조합 기술: 생물체에서 추출한 DNA 분자의 단편이나 인공적으로 합성한 DNA를 시험관 내에서 효소 등을 사용하여 플라스미드나 바이러스 등의 자기 증식성 DNA에 인위적으로 결합해 세포 내에 도입하여 증식시키는 실험 및 그처럼 해서 얻어진 재조합 DNA 분자를 사용한 실험입니다.

- 효소 파트의 핵심 요약정리
 효소의 본체는 단백질이기 때문에 일반적으로 단백질의 변성 요인의 영향을 받습니다.
 효소는 아미노산이 펩타이드 결합으로 구성된 단백질이고, 효소는 제한된 종류의 화학반응 또는 어느 특정한 한 가지 반응에만 관여하는 특이성을 가지고 있습니다.
 효소는 단순 또는 복합단백질로서 단백질 분해효소에 의해 분해되고 열과 pH에 의해 변성되어 그 활성을 잃게 됩니다.
 충돌하는 분자들이 활성화 에너지를 가지고 있을 때 화학반응은 일어납니다.
 가역적 저해는 효소의 어떤 결합 부위에 저해제가 가역적으로 결합하여 효소의 작용을 저해하는 것을 말하며, 경쟁적 저해(competitive inhibition)와 비경쟁적 저해(non-competitive inhibition)는 나눌 수 있습니다.
 유전자 재조합 기술은 동물 또는 식물 유전자를 미생물에 넣어 전통적인 발효 기술을 사용하면 종래 생산하기 어려웠던 효소를 생산할 수 있습니다.

 효소의 구조와 활성은 온도와 pH에 의해 변화합니다. 적당한 온도 증가는 효소와 기질 사이의 충돌수를 증가시키므로 대부분 화학반응 속도는 온도가 높아질수록 증가합니다. 그러나 효소는 단백질이므로 높은 온도에서는 변성됩니다. 효소가 최고의 촉매 활성을 나타내는 온도를 최적 온도라고 합니다. 최적 온도보다 더 높은 온도에서는 효소의 활성이 현저하게 감소하게 됩니다. 효소의 촉매 활성은 활성 자리의 이온화 상에 따라 변합니다. 대부분 효소는 좁은 pH 범위 내에서 촉매 활성을 나타냅니다. 최고의 촉매 활성을 나타내는 pH를 최적 pH라고 합니다. 최적 pH는 효소의 종류에 따라 달라서 펩신은 pH 2이고, 키모트립신의 최적 pH는 8입니다.
 경쟁적 저해물질은, 기질과 구조가 매우 유사하여 효소의 활성자리에 가역적으로 결합하는 것을 말합니다. 따라서 효소-저해제 복합체가 존재하면 효소의 활성은 감소합니다. 이러한 경쟁적 저해제의 효과는 기질의 농도를 증가시켜 극복할 수 있습니다. 이때 Km은 증가시켜, Vax는 변하지 않습니다. 경쟁적 저해 시에는 Km 값이 증가하고, 반응 생성물이 많아질수록 반응 속도는 느려집니다.
 활성화 에너지는 기질이 기저상태(안정되고 에너지가 낮은 형태의 분자)에서 전이상태(반응의 정점)까지 올리는 데 필요한 에너지입니다. 충돌하는 분자들이 활성화 에너지를 가지고 있을 때 화학반응은 일어납니다.