'효소 고정화' 네 가지 방법! 효소를 얻는 급원, 효소를 이용한 '유전자 재조합'의 모든 것

효소를 어떤 일정한 공간에 물리적으로 갇히게 한 상태이거나 촉매 활동을 유지하므로 반복해서 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 반응 후에는 회수하여 재이용할 수 있게 하는 과정을 효소의 고정화라고 합니다. 효소의 고정화 방법에는 흡착, 공유결합, 가교, 포괄 법 등이 있습니다.

1. 고정화 방법
 흡착
효소를 담체의 표면에 물리적으로 흡착시키는 것입니다. 이는 생체에서 세포막에 결합한 효소와 유사합니다. 이 방법에 쓰이는 담체로는 활성탄, 다공성 유리, 산성 백토, 카올리 나이트 등 무기물 외에 전분, 키틴, 글루텐과 같은 천연 고분자나 소수성 기를 가진 아가로서 유도체 등이 있습니다. 흡착은 가역적 반응이기 때문에 pH, 이온 세기 등에 의해 탈리될 수 있다는 장점이 있습니다. 하지만 이 방법은 조작이 간단하고 효소 단백질의 활성 중심 파괴 또는 고차구조의 변화가 최소화된다는 장점도 있습니다.

 공유결합
수용성 효소를 불용성 담체에 공유 결합시키는 것은 효소의 고정화 방법에서 가장 많이 쓰이는 방법입니다. 효소는 단백질이어서 아미노산 족쇄는 결합반응에 적합한 여러 개의 작용 그룹을 가지고 있습니다. 일반적으로 효소 고정화는 두 단계가 있습니다. 첫 번째는 담체를 시약으로 처리하여 작용 그룹을 활성화하고, 두 번째는 활성화된 담체를 효소와 혼합함으로써 결합이 이루어지는 것입니다. 글루 테르 알데하이드가 식품 산업체에서 흔히 사용되는 것입니다. 공유결합은 효소 결합 과정 중 효소 활성의 일부가 손실될 수 있지만, 담체에서 효소가 떨어져 나올 가능성이 적기 때문에 효소가 가장 안정하다는 장점이 있습니다.
흡착은 효소를 담체의 표면에 물리적으로 흡착시키는 것이고, 공유결합은 수용성 효소를 불용성 담체에 공유 결합시키는 것으로 효소의 고정화 방법에서 가장 많이 쓰이는 방법입니다. 포괄 법은 기질이나 생성물이 고분자인 경우에는 이 방법을 사용할 수 없습니다.

 가교
효소를 가교화 하면 커다란 응집체가 형성되어 물에 녹지 않습니다. 이렇게 함으로써 효소는 촉매와 동시에 지지 물체가 됩니다. 그리로 테를 알게 라이드가 가장 흔히 사용되는 가교 시약입니다. 흔히 가교는 물리적 흡착으로 효소를 고정화한 후에 효소를 안정화합니다.

 포괄 법
젤의 미세한 격자 안에 효소를 집어넣는 격자형과 반투막 성의 폴리머 피막으로 효소를 피복하는 미세 캡슐형으로 나눕니다. 폴리 아크릴 아마이드 겔이 효소 고정화에 가장 많이 사용됩니다. 트립신, 파파인 등이 이 방법에 의해 최초로 고정화되었습니다. 포괄 법은 흡착이나 공유결합과 달리 효소 단백질 자체와는 결합반응을 일으키지 않으므로 더 많은 효소의 고정화에 사용될 수 있습니다. 기질이나 생성물이 고분자인 경우에는 이 방법을 사용할 수 없습니다. 

- 효소의 급원
지금까지 배운 효소의 물리 화학적 특징을 활용하면 다양한 식품 산업에서 쓰일 수 있고, 더 나아가 유전자 재조합 기술과 같은 공업적인 생산에 적용할 수도 있습니다. 상업적으로 중요한 효소의 대부분은 제한된 범위의 미생물로부터 생산되고 있는데. 몇몇 효소의 예를 들면 pancreatic lipase, trypsin 등을 전통적으로 동물 급원에서 얻고 있는데, 이들도 미생물에서 유래한 비슷한 효소로 대체될 것으로 예상됩니다. 그러나 미생물 대체 효소는 활성은 높으나 공정에 유래한 비슷한 효소로 대체될 것으로 보입니다. 그러나 미생물 대체 효소는 활성은 높으나 공정에서 응용할 때 중요한 성질에서 미묘한 차이를 보일 수 있습니다. 따라서 동물 유전자를 적절한 박테리아나 효모에 클로닝 하여 재래적인 발효 공학을 사용하여 동물 효소를 생산하는 유전자 재조합 기술이 사용되고 있습니다.

 

식물은 전통적으로 제한된 숫자의 효소 급원으로 사용되어 왔습니다. 특히 파파야, 무화과, 파인애플 등의 라텍스로부터 시스테인 단백질 분해효소가 분리되고 있습니다. 이들 라텍스는 많은 양의 효소를 함유하고 있으므로 보통 태양 아래에서 건조하여 조효소로 직접 사용할 수 있습니다. 식물에서 유래한 효소 중 다른 중요한 급원은 맥아로, 양조산업에는 전통적으로 맥아를 여러 가지 단백질 분해효소 및 당 가수분해 효소의 급원으로 사용하여 왔습니다. 효소는 무게나 부피가 아닌 효소 활성 단위로 판매되며 항상 염, 보존제, 안정제, 중량제, 비 효소적 유기물 등을 함유하고 있습니다.

 유전자 재조합 기술
급속히 발전한 유전자 재조합 기술은 상업적 효소 생산에 많은 이점을 제공하고 있습니다. 동물 또는 식물 유전자를 미생물에 넣어 전통적인 발효 기술을 사용하면 종래 생산하기 어려웠던 효소를 생산할 수 있습니다. 외래 DNA를 미생물에 클로닝 하는 데에는 여러 가지 전략이 있습니다. 기본적인 유전자 클로닝 전략은 원하는 DNA 분자를 얻고, DNA 절편을 클로닝 운반체에 연결하고, 재조합 DNA를 숙주에 집어넣고, 원하는 클론을 확인하는 것입니다. 가장 간단한 전략은 shot-gun 클로닝에 의해 한 종의 박테리아 유전자를 다른 박테리아에 집어넣는 것입니다.

1. 원하는 DNA 절편 확보
DNA 절편을 얻기 위하여 DNA를 제한효소로 분해하거나 기계적 절단, 두 가작 cDNA 합성 및 직접 기계적 합성 방법이 있습니다. 제공 생물체의 DNA를 분리하여 적절한 효소 특이성을 가진 제2형 제한효소로 부분적으로 분해합니다. 제한효소는 DNA 분자 내의 특정 뉴클레오타이드 배열 순서를 인식하여 DNA 두 가닥을 부착성 또는 뭉툭한 말단으로 절단합니다. 동일한 효소로 플라스미드와 같은 적절한 운반체를 절단합니다. 진핵생물 유전자는 번역되지 않는 인트론을 함유하고 있어서 직접 박테리아에 클로닝 하였을 때 발현되지 않습니다. 진핵생물의 mRNA를 분리한 후 역전사 효소를 이용해서 DNA의 상보적 사슬인 cDNA를 만들어야 합니다. 

DNA 절편을 확보한 후 이를 클로닝 운반체에 연결하고 숙주세포 안에 넣는 과정은 다음 포스팅에서 더 자세히 다뤄보도록 하겠습니다.